فصل هفتم: اسید نوکلئیک: ساختار DNA و همانندسازی آن

مقدمه

کشف ساختار دئوکسی نوکلئیک اسید (DNA[1])، علم زیست‌شناسی را متحول کرد. اطلاعات به شکل کدهایی در DNA ذخیره می­شوند و سپس به شکل ریبونوکلئیک اسید پیام رسان (mRNA[2]) رونوشت می شوند. ساختار DNA کاملاً با عملکردش متناسب است. اطلاعات منتقل شده از DNA به mRNA در نهایت به توالی‌های آمینواسیدی ترجمه می‌شوند.

7.1 ساختار DNA و همانندسازی آن

مفاهیم

  • ساختار DNA، تعیین کننده مکانیسم همانندسازی است.
  • نوکلئوزوم‌ها به سوپرکویل شدن(در هم تنیدگی پیچشی) DNA کمک می‌کنند.
  • همانندسازی DNA در رشته پیشرو پیوسته و در رشته پیرو به شکل ناپیوسته انجام می‌شود.
  • همانندسازی DNA به کمک سیستم پیچیده‌ای از آنزیم‌ها انجام می­شود.
  • DNA پلیمرازها، نوکلئوتیدها را به سر 3’ پرایمر اضافه می­کنند.
  • برخی از مناطق DNA کدکننده پروتئین نیستند ولی نقش‌های مهمی دارند.

ماهیت علم

  • مشاهدات دقیق: روزالیند فرانکلین[3] به کمک پراش اشعه ایکس، شواهد مهمی پیرامون ساختار مارپیچ‌دوگانه DNA، کشف کرد.

کاربرد علم

  • فرانکلین و ویلکینز[4] ساختار DNA را با استفاده از پراش اشعه ایکس بررسی کردند.
  • مطالعه توالی­های تکراری پشت سر هم (Tandem) برای دریافت پروفایل مشخصات DNA مورد استفاده قرار می گیرد.
  • استفاده از نوکلئوتیدهای دی دئوکسی ریبونوکلوئیک اسید(dDNA) جهت توقف همانندسازی در فرآیند آماده‌سازی نمونه‌های توالی یابی.

مهارت‌آموزی

  • تحلیل نتایج آزمایش هرشی[5] و چیس[6]؛ آن­ها نشان دادند DNA ماده ژنتیکی سلول است.
  • استفاده از نرم‌افزارهای تصویرسازی مولکولی برای بررسی ارتباط بین پروتئین و DNA در نوکلئوزوم.

آزمایش Hershey – Chase

تحلیل نتایج آزمایش هرشی و چیس؛ آن­ها نشان دادند، DNA ماده ژنتیکی سلول است.

دانشمندان از اواخر دهه 1800 میلادی این حقیقت را  پذیرفتند که کروموزوم‌ها در توارث نقش دارند و ماده ژنتیکی باید ماهیت شیمیایی داشته باشد، آن­ها با آگاهی از اینکه کروموزوم‌ها از نوکلئیک اسید و پروتئین تشکیل شده‌اند، نتیجه گرفتند که ماده ژنتیکی نوکلئیک اسیدی یا پروتئینی است. تا دهه 1940 میلادی، اکثر دانشمندان به این علت که تنوع پروتئین‌ها با داشتن 20 زیرواحد متفاوت(آمینواسید) بیشتر از نوکلئیک اسید­ها با 4 زیر واحد متفاوت (نوکلئوتید) است و عملکردهای متعددی دارد، تصور می­کردند که ماهیت ماده ژنتیکی پروتئینی است. در آن زمان، تنوع و عملکرد اختصاصی، دو ویژگی لازم برای توصیف ماده توارثی در نظر گرفته می­شد.

آلفرد هرشی و مارتا چیس سعی کردند تا ماهیت ماده ژنتیکی ویروس‌ها را توصیف کنند. در دهه 1950 میلادی، ویروس‌ها به شکل ذرات عفونی شناخته می­شدند که با اتصال به سلول‌های میزبان و تزریق ماده ژنتیکی خود درون

آن‌ها، سلول را به کارخانه تولید ویروس تبدیل می‌کنند. در اینصورت بخش غیرژنتیکی ویروس خارج از سلول میزبان باقی می‌ماند و سلول آلوده شده تعداد زیادی ویروس تولید می‌کند که در نهایت به واسطه تجمع ویروس‌ها درون سلول، سلول از هم می­پاشد و ویروس‌ها در محیط آزاد می­شوند(شکل شماره 1). ویروس‌ها اغلب بطور ویژه نوع خاصی از سلول­ها را آلوده می­کنند. ویروسی که  توسط هرشی و چیس مورد مطالعه قرار گرفت، باکتریوفاژ T2 بود؛ زیرا ساختار بسیار ساده‌ای دارد. پوشش این ویروس کاملاً از جنس پروتئین است و محتوای ژنتیکی  ویروس در فضای داخلی این پوشش قرار گرفته است.

 

طرح سوال مبتنی بر داده: آزمایش Hershey و Chase

هرشی و چیس دو دانشمندی بودند که روی ماهیت شیمیایی ماده ژنتیکی مطالعه ‌کردند. آن­ها در مطالعاتشان از این واقعیت بهره بردند که نوکلیئک اسیدها بر خلاف پروتئین­ها حاوی فسفر هستند و گوگرد ندارد، در حالی که پروتئین­ها فاقد فسفر و دارای گوگرد می باشند.. آن‌ها ویروس‌هایی با پوشش پروتئینی حاوی گوگرد رادیواکتیو (35S)  و ویروس‌هایی با DNA حاوی فسفر رادیواکتیو(32P) را به صورت جداگانه همراه با باکتری کشت دادند. سپس با استفاده از مخلو­ط­کن[7] اجزای غیرژنتیکی ویروس را از سلول جداکردند و سپس محیط کشت را سانتریفیوژ کردند تا اجزای سلولی رسوب کنند. آن­ها انتظار داشتند که درون سلول‌ها اجزای رادیواکتیو ویروسی وجود داشته باشد به همین دلیل میزان رادیواکتیویتی را در رسوب و مایع رویی (سوپرناتانت) بررسی کردند. شکل 3 فرآیند آزمایش و نتایج آن را نشان می‌دهد.

پرسش‌

  • محتویات مایع رویی(سوپرناتانت[8]) چیست؟
  • چرا ماده ژنتیکی در رسوب وجود دارد و در سوپرناتانت نیست؟ توضیح دهید.
  • درصد 32P باقی‌مانده در سوپرناتانت را تعیین کنید.
  • درصد 35S باقی‌مانده در سوپرناتانت را تعیین کنید.
  • شواهدی که نشان می­دهد DNA، باکتری را به سلول‌های آلوده تبدیل می‌کند، بیان کنید.

استفاده از الگوهای پراش اشعه ایکس برای تعیین ساختارهای مولکولی

مشاهدات دقیق: روزالیند فرانکلین به کمک پراش اشعه ایکس، شواهد مهمی پیرامون ساختار مارپیچ‌دوگانه DNA، کشف کرد.

در رابطه با کشف ساختار DNA، دو نام بیشتر از بقیه مطرح می‌شوند: واتسون[9] و کریک[10]. شکی نیست که نبوغ بالای، این دو محقق یکی از عوامل  موفقیت ایشان بوده است ولی اگر آزمایش­های ماهرانه سایر دانشمندان نبود، واتسون و کریک هیچگاه نمی­توانستند ساختار DNA را کشف کنند. یکی از این دانشمندان اروین چارگف[11] بود. تحقیقات او درباره درصد بازهای تشکیل دهنده DNA، در پرسش بخش 2.6 توضیح داده شده است.

چهره کلیدی دیگر در کشف ساختار DNA روزالیند فرانکلین است. در سال 1950 او به عنوان دستیار تحقیق در بخش فیزیک کالج سلطنتی لندن مشغول به کار شد. پیش از استخدام وی، تحقیقات روی ساختار DNA به وسیله پراش اشعه ایکس در گروه فیزیک دانشگاه، آغاز شده بود. فرانکلین قبل از ورود به کالج لندن، در مؤسسه تحقیقاتی در پاریس روی ترکیبات کربنی کار می‌کرد و به تکنیک‌های کریستالوگرافی و پراش اشعه ایکس مسلط شده بود.

در کالج سلطنتی، او توانست با افزایش میزان وضوح یک دوربین با دقتی بسیار بهتر از قبل الگوهای پراش اشعه ایکس را اندازه­گیری کند. او همچنین نمونه‌های با کیفیتی از DNA را تولید کرد و توانست با تنظیم دقیق رطوبت به میزان قابل توجهی از خلوص DNA برسد در ادامه این دو مورد از این نمونه­ها را به گونه‌ای که مولکول‌ها در فیبرهای بسیار نازکی کنار هم ردیف شده بودند مورد بررسی قرار داد و چون از میزان و کیفیت خلوص نمونه­ها مطمئن نبود هر دو نمونه را مطالعه کرد. ..

به سرعت پس از شروع کار در کالج سلطنتی، فرانکلین توانست شفاف­ترین تصاویر را از انکسار DNA به دست آورد. آن تصاویر به عنوان “یکی از زیباترین عکس­های گرفته شده به کمک اشعه ایکس” توصیف شده است. فرانکلین تا زمانی که به شواهد محکمی دست پیدا نکرده بود، تمایلی به انتشار یافته‌هایش نداشت. سپس فرانکلین آنالیز بسیار دقیقی روی الگوی پراش اشعه ایکس انجام داد که در نهایت می­توانست قطر مارپیچ DNA را محاسبه کند.

بدون اطلاع و یا اجازه فرانکلین، بهترین الگوی انکساری از DNA به واتسون نشان داده شد و وی محاسباتش را بر پایه همین تصاویر انجام داد. پیش از آن که فرانکلین بتواند نتایج مطالعاتش را به چاپ برساند، واتسون و کریک بر اساس نتایج فرانکلین مدل خود از ساختار DNA را ارائه کردند و در سال 1962 مفتخر به دریافت جایزه نوبل شدند. بسیاری معتقدند که این مطالعات، فرانکلین را سزاوار دریافت جایزه نوبل می‌کرد اما این مسئله هیچ گاه اتفاق نیفتاد؛ او سرانجام در سال 1958 در سن 37 سالگی به علت بیماری سرطان درگذشت. امکان اعطای جوایز نوبل به درگذشتگان وجود ندارد اما روزالین فرانکلین بیش از هر برنده نوبلی در یادها باقی مانده است. چیزی که ما می‌توانیم از زندگی او بیاموزیم این است که شاید گاهی اکتشافات علمی در اثر تصادف و یا شانس محقق شوند اما قطعاً علم بر پایه تکنیک‌های دقیق آزمایشگاهی و مشاهدات ریزبینانه بنا شده است.

مطالعات روزالیند فرانکلین روی ساختار DNA

فرانکلین و ویلکینز ساختار DNA را با استفاده از پراش اشعه ایکس بررسی کردند.

بخش قابل توجهی از پرتوی ایکس تابیده شده به سمت مواد از آن‌ها‌ عبور می‌کند ولی مقداری از این پرتو توسط ذرات ماده پراکنده می‌شود. به این پراکنش، انکسار[12] می‌گویند. طول موج پرتو ایکس باعث می­شود که این پرتو نسبت به انکسار از  ذرات مولکول­های زیستی مانند DNA، حساس شود.

در فرم کریستالی، ذرات در یک الگوی منظم تکراری سازماندهی شده‌اند، بنابراین انکسار به شکل منظم اتفاق می‌افتد. DNA کریستالی نمی­شود ولی در نمونه‌های فرانکلین به منظور دستیابی به یک الگوی انکساری منظم (به جای پراکنش نامنظم) مولکول‌ها به اندازه کافی سازماندهی شده بودند. یک آشکارساز پرتوایکس[13] برای متمرکز کردن پرتوهای پراکنده شده، در نزدیکی نمونه قرارداده شد. نمونه می­تواند در سه جهت مختلف به منظور بررسی الگوی پراکنش بچرخد. الگوهای انکساری را می‌توان به وسیله فیلم­های پرتوی ایکس ثبت کرد. فرانکلین برای ثبت تصاویر بسیار شفاف از الگوهای انکساری DNA، یک دوربین با وضوح بالا ساخت. شکل شماره 4، معروف­ترین الگوی انکساری ثبت شده را نشان می­دهد.

به کمک الگوی انکساری نشان داده شده در شکل شماره 4، فرانکلین به نتیجه‌گیری‌هایی در خصوص ساختار DNA دست پیدا کرد:

  • شکل ضربدری وسط الگو، نشان دهنده مارپیچی بودن شکل مولکول است.
  • زاویه ضربدر، نشان دهنده زاویه شیب مارپیچ است
  • فاصله بین میله‌های افقی، نشان ‌دهنده آن است که چرخش‌های مارپیچ هرکدام 4 نانومتر از هم فاصله دارند.
  • فاصله بین مرکز الگوی انکساری تا بالای آن، نشان می‌دهد که درون مولکول ساختاری تکراری به فاصله 0.34 نانومتری بین هر تکرار وجود دارد. این مسئله بیان کننده فاصله عمودی بین جفت بازهای کنار هم در مارپیچ است.

مدل واتسون و کریک، همانندسازی نیمه حفاظت شده DNA را نشان داد.

ساختار DNA مکانیسمی را برای همانندسازی آن پیشنهاد می‌کند.

شواهد آزمایشگاهی بسیاری درکنار هم جمع آوری شدند تا در نهایت مفهومی از ساختار DNA به دست آید: این مفاهیم مقرون تلاش­های مدل سازی مولکولی لینوس پاولینگ[14]، الگوهای انکسار پرتوی ایکس به دست آمده توسط روزالیند فرانکلین و مطالعه روی ترکیب بازها توسط اروین چارگف بود ولی در نهایت در کنار همه این‌ها بینش و تصویرسازی نیز نقش مهمی داشت.

یکی از اولین مدل‌های واتسون و کریک از رشته‌های قند-فسفات تشکیل می­شد که با بازهای نیتروژنی مقابل هم، به دور یکدیگر پیچ می‌خورند. روزالیند فرانکلین با اطلاع از اینکه بازهای نیتروژنی در مقایسه با اسکلت قند-فسفات نسبتاً هیدروفوب هستند و احتمالاً در مرکز مارپیچ قرار می‌گیرند، مدل اولیه واتسون و کریک را نقض کرد.

مطالعات پراش پرتو ایکس، نشان داد که مارپیچ DNA بسیار متراکم است؛ بنابراین زمانی که واتسون و کریک به دنبال ساخت مدل­هایی برای ساختار DNA بودند، باید بازهای مکملی را انتخاب می‌کردند تا دو رشته DNA فاصله زیادی از یکدیگر نگیرند. واتسون و کریک با امتحان کردن مدل­های مختلف، متوجه شدند اگر یک باز پیریمیدینی با یک باز پورینی مکمل شود، به‌گونه‌ای که نسبت به هم وارونه باشند، مدل متراکم DNA به دست می‌آید. علاوه بر شباهت ساختاری، آدنین یک بار الکتریکی منفی و تیمین یک بار الکتریکی مثبت دارد. در نتیجه این دو از نظر الکتریکی با یکدیگر سازگار هستند. جفت شدن سیتوزین و گوانین باعث تشکیل سه پیوند هیدروژنی و افزایش پایداری مولکول می­شود.

نظریه علم

رویکرد دانشمندان هنگامی که فرضیه­ها و پیش­بینی‌ها با شواهد آزمایشگاهی همخوانی ندارند،چگونه است؟

چارگف درباره مشاهداتش نوشته است:” نتایج، بدست آمده اعتبار  فرضیه تترانوکلئوتیدی را زیر سوال می­برد.. با این وجود هنوز نمی‌توانیم بگوییم که دستاورد به دست آمده از مقایسه نسبت مولی پورین­ها به پریمیدین­ها در تمام دئوکسی پنتوز نوکلئیک اسید‌های بررسی شده اتفاقی است یا خیر. داده‌­ها نشان می­‌دهد، نسبت مولی پورین‌ها به پیریمیدین‌ها که شامل نسبت مولی آدنین‌ها به تیمین‌ها و گوانین‌ها به سیتوزین‌ها است که عددی نزدیک به 1 می­‌باشد،

هنری اچ.باور(H. H. Bauer) نویسنده کتاب سواد علمی و افسانه روش علمی، می­گوید:” چارگف نیاز داشت تا سرش فراتر از نتایج واقعی نگاه کند و تفاوت‌های جزئی بین اعداد به دست آمده را نادیده بگیرد و بگوید که این نتایج، دقیقاً بیان کننده یکسان بودن تعداد بازهای مطرح شده و  جفت شدگی بین آن‌ها در ساختار مولکولی هست…… در عوض واتسون و کریک با تفکر پیرامون این مسئله، تئوری‌هایی در خصوص ماهیت مولکولی و عملکردهای زیستی DNA  ارائه دادند و در نهایت با این فرض که نسبت‌های مطرح شده بین بازها دقیقاً برابر با 1 است و اختلافات جزئی بین اعداد به خاطر خطا در آزمایش به وجود آمده‌اند، مدل خود را ارائه کردند. ایده‌ها و تئوری‌ها قطعاً راهنمای بهتری نسبت به داده‌های خام برای کشف حقایق علمی هستند.”

 

واتسون و کریک همزمان با ارائه مدل خود درمورد ساختار ِDNA، مکانیسم جفت شدن مکمل بازها را نیز  برای همانندسازی DNA پیشنهاد دادند. پاسخ دادن به چگونگی همانندسازی، یکی از اصلی‌ترین ملزومات هر مدل پیشنهادی DNA بود. مدل واتسون و کریک در نهایت فرضیه همانندسازی نیمه حفاظت شده DNA را ارائه داد.

نقش نوکلئوزوم‌ها در بسته‌بندی DNA

نوکلئوزوم‌ها به سوپرکویل(ابرمارپیچ) شدن DNA کمک می‌کنند.

یکی از تفاوت‌های بین DNA یوکاریوتی و DNA پروکاریوتی این است که DNA یوکاریوتی با پروتئین‌هایی به نام هیستون‌ها مرتبط است. بسیاری از گروه‌های پروکاریوتی DNA متصل به هیستون ندارند یا DNA آن­ها با پروتئین‌های شبه هیستونی در ارتباط است. به این دلیل، به DNAهای پروکاریوتی، برهنه[15] می‌گویند.

هیستون‌ها برای بسته‌بندی DNA در ساختارهایی به نام نوکلئوزوم استفاده می­شوند. یک نوکلئوزوم از یک هسته مرکزی شامل هشت پروتئین هیستون به همراه DNA تابیده شده به دور پروتئین‌ها تشکیل می‌شود. هشت پروتئین هیستون که اکتامر نام دارند، از دو کپی از چهار تیپ مختلف هیستون تشکیل شده‌است. یک بخش کوچک از DNA “رابط[16]” یک نوکلئوزوم را به نوکلئوزوم کناری متصل می‌کند. مولکول هیستون اضافی به نام H1، DNA را به هسته اکتامری وصل می‌کند. (شکل شماره 5)

ارتباط هیستون‌ها با DNA در نهایت یک الگوی ابر مارپیچی ایجاد می­کند. مثلاً  اگر شما یک بند پلاستیکی را مرتباً پیچ و تاب بدید در نهایت الگویی از مارپیچ‌ها ایجاد می‌شود. ابرمارپیچ شدن DNA به او اجازه می‌دهد که با وجود طول بسیار زیاد در فضای بسیار کوچکی مانند فضای هسته قرار بگیرد. ایجاد ساختار نوکلئوزومی در حقیقت سازگاری است که ژنوم‌های بزرگ یوکاریوتی برای این هدف پیداکرده­اند. اتصال هیستون H1 باعث تشکیل ساختار  فیبر 30 نانومتری DNA می‌شود که این ساختار، متراکم شدن بیشتر DNA را تسهیل می‌کند.

تصویرسازی  نوکلئوزوم‌ها

استفاده از نرم‌افزارهای تصویرسازی مولکولی برای بررسی ارتباط بین پروتئین­ و DNA در نوکلئوزوم
از پایگاه داده پروتئین به نشانی www.rcsb.org/pdn/home بازدید کنید. از این وبسایت  یا وبسایت‌های مشابه‌ای که در سایر بخش‌های کتاب معرفی شده‌اند، تصویر یک نوکلئوزوم را دانلود کنید.

  • تصویر را بچرخانید تا دو کپی از هر پروتئین هیستونی را ببینید. در شکل شماره 6، آن‌ها به وسیله دنباله­هایی که از هسته نوکلئوزوم گرفته شده­‌اند، قابل شناسایی هستند. هر پروتئین دنباله­ای دارد که از  هسته نوکلئوزوم به سمت بیرون آن گسترش یافته است.
فعالیت

تعیین نسبت بسته بندی(packing)

طول DNA تقسیم بر طول آن چیزی که DNA قرار است در آن بسته بندی شود، نسبت بسته بندی گفته می­شود. از اطلاعات زیر برای تخمین نسبت بسته بندی استفاده کنید:

1-  یک نوکلئوزوم

2- کروموزوم 22 (یکی از کوچکترین کروموزوم‌های انسانی)

·                      فاصله بین جفت باز‌ها 0.34 نانومتر است.

·                      تقریباً 200 جفت باز از DNA به دور یک نوکلئوزوم تاب می‌خورد.

·                      یک نوکلئوزوم حدود 10 نانومتر طول دارد.

·                      حدود 5.0×107  جفت باز در کوتاه‌ترین کروموزوم اتوزومی انسان ( کروموزوم 22) وجود دارد.

·                      کروموزوم 22 در متراکم‌ترین شکل، حدود 2 میکرومتر طول دارد.

 

  • توجه کنید تقریباً 150 جفت باز از DNA، حدود دو دور به دور هسته اکتامری تاب خورده است.
  • توجه کنید دنباله انتهای N (N – terminal) از هر پروتئین هسته بیرون زده­است. تغییرات شیمیایی این دنباله در تنظیم بیان ژن نقش دارد.
  • اسیدآمینه­‌های با بار مثبت را در هسته نوکلئوزومی تجسم کنید. نقش این اسیدآمینه‌ها را در برقراری ارتباط بین هسته پروتئینی و DNA (با بار منفی) توضیح دهید.

 

طرح سوال مبتنی بر داده: مرگ سلولی برنامه­‌ریزی­‌شده[17] و طول DNA بین نوکلئوزوم‌ها

در شرایط طبیعی، گاهاً مرگ سلولی­ برنامه‌ریزی­‌شده در سلول‌ها رخ می‌دهد.  به این فرآیند آپوپتوز می‌گویند و نقش مهمی در دگردیسی و تکوین جنینی دارد. یکی از فرآیندهای خود تخریبی سلول‌ها، تخریب DNA توسط آنزیم DNAase است. در شرایط عادی، DNA متصل به هیستون‌ها در نوکلئوزوم­ها حتی به اندازه DNA رابط در دسترس DNAase نیست. DNA توسط آنزیم به قطعاتی معادل چند برابر فاصله بین نوکلئوزوم‌ها تقسیم می‌شود.

ستون سمت چپ در شکل شماره 7، جداسازی DNA سلول کبدی موش با DNAse به وسیله ژل الکتروفورز را نشان می­دهد. ستون سمت راست نشان دهنده قطعاتی است که به عنوان مرجع اندازه قطعات (ladder) استفاده می‌شوند.

به محض برش DNA توسط آنزیم DNAase، نوکلئوزوم‌ها نیز توسط پروتئاز هضم شدند.

  • روی تصویر، قطعاتی را مشخص کنید که نشان دهنده :

الف) طولی از DNA که بین دو بخش از DNA رابط در هر دو طرف از یک نوکلئوزوم وجود دارد.

ب) طولی از  DNA بین دو ناحیه از DNA رابط  که دو نوکلئوزوم بین آن‌ها وجود دارد. ج) طولی از DNA بین دو ناحیه از DNA رابط که سه نوکلئوزوم بین آن‌ها وجود دارد.

  • طول DNA مرتبط با یک نوکلئوزوم را مشخص کنید.
  • اگر غلظت بالایی از DNAase به سلول اضافه شود، الگوی نشان داده شده در ستون سمت چپ چگونه تغییر می‌کند؟

رشته پیشرو و رشته پیرو

همانندسازی DNA روی رشته پیشرو به شکل پیوسته و روی رشته پیرو، ناپیوسته انجام می‌شود.

مارپیچ دو رشته DNA به شکل موازی و خلاف جهت یکدیگر قرار گرفته‌اند، در نتیجه سنتز این دو رشته نسبت به هم متفاوت است. در یک رشته DNA، زمانی که چنگال همانندسازی باز می­شود، فرآیند همانندسازی در رشته پیشرو، ، به شکل پیوسته ولی در رشته مقابل، رشته پیرو، به صورت قطعه قطعه انجام می‌شود. قطعات جدید  در رشته پیرو زمانی ایجاد می‌شوند که چنگال همانندسازی به سمت نواحی بیشتری از رشته الگو پیش می­رود. به این قطعات تشکیل شده در رشته پیرو ، به این قطعات جدید ناپیوسته، قطعات اوکازاکی[18] می‌گویند.

پروتئین‌های دخیل در همانندسازی

همانندسازی DNA به کمک سیستم پیچیده‌ای از آنزیم‌ها انجام می­‌شود.

همانندسازی شامل تشکیل و حرکت چنگال همانندسازی روی دو رشته DNA و سنتز از روی رشته‌های پیشرو و پیرو است. پروتئین‌های چنگال همانندسازی علاوه­بر اینکه به شکل آنزیم در انجام هر مرحله نقش دارند کاربردهای دیگری نیز دارند.

آنزیم هلیکاز دو رشته DNA در چنگال همانندسازی را از هم باز می‌کند و آنزیم توپوایزومراز پیچ و تاب ایجاد شده در جلوی محل فعالیت هلیکاز را از بین می‌برد. پروتئین‌های متصل شونده به ِDNA تک رشته ([19]SSBP) مانع از اتصال مجدد دو رشته شده و آن­ها را به اندازه کافی از یکدیگر دور نگه می‌دارند تا رشته الگو، فرصت همانندسازی داشته باشد.

برای شروع همانندسازی به اولیگونوکلئوتیدهایی (پرایمر[20]) از جنس RNA نیاز است. توجه کنید که برای سنتز از روی رشته پیشرو فقط یک پرایمر ولی در رشته پیرو تعداد زیادی پرایمر استفاده می­شود.آنزیم DNA Primase، پرایمر را با استفاده از نوکلئوتید­هایی از جنس RNA،  از روی رشته پیشرو و تعداد زیادی روی رشته پیرو  می سازد و در مقابل چنگال همانندسازی قرار می­دهد. حضور پرایمر برای شروع فعالیت آنزیم DNA  پلیمراز ضروری است.

آنزیم DNA پلیمراز مسئول اتصال کوالانسی فسفات دئوکسی ریبونوکلئوتید به سر 3’ رشته در حال سنتز است. موجودات مختلف، DNA پلیمرازهای مختلفی دارند که هر کدام ویژگی‌های مختلفی از جمله proof-reading، حذف پرایمر RNA و پلیمریزاسیون دارند.

در رشته پیرو که قطعات ناپیوسته سنتز می­شوند، آنزیم DNA لیگاز فاصله بین قطعات DNA را پر و آن­ها را به یکدیگر متصل می­کند.

جهت همانندسازی

DNA پلیمرازها نوکلئوتیدها را به سر’3 پرایمر اضافه می­کنند.

در مولکول‌های DNA، همانندسازی در ناحیه­ای به نام نقطه شروع همانندسازی ( Origin of replication) آغاز می‌شود. در پروکاریوت‌ها یک نقطه و در یوکاریوت‌ها تعداد زیادی نقاط شروع همانندسازی وجود دارد. همانندسازی در هر دو جهت نسبت به نقطه شروع همانندسازی ادامه پیدا می‌کند. این مسئله به شکل یک حباب همانندسازی در میکروگراف‌های الکترونی مشاهده می‌شود.

پنج کربن قند دئوکسی ریبوز دارای شماره هستند (تصویر 9 مشاهده شود).

 

گروه فسفات نوکلئوتید‌های DNA جدید به کربن’3 دئوکسی ریبوزِ نوکلئوتید انتهای زنجیره وصل می‌شوند. بنابراین همانندسازی در جهت’ 5 به’3 انجام می‌شود.

نقش‌ مهم نواحی رمزگذاری نشده DNA

برخی از توالی DNA در ژنوم کدکننده پروتئین­ها نیستند ولی نقش‌های مهمی دارند.

فرآیندهای سلولی بر اساس کدهای ژنتیکی انجام می‌شوند. توالی کدهای ژنتیکی، راهنمای سنتز پلی پپتیدها است. بنابراین فقط تعداد محدودی توالی برای سنتز پلی‌پپتیدها وجود دارد. به این‌ توالی‌ها، توالی­های رمزگذار می‌گویند. در ژنوم تعدادی توالی غیر رمزگذار هم یافت شده است. برخی از این‌ توالی­ها، توالی‌هایی هستند که به عنوان راهنمای سنتز tRNA[21] و [22]rRNA مورد استفاده قرار می‌گیرند. برخی دیگر از نواحی غیر رمزگذار نقش‌ مهمی در تنظیم بیان ژن دارند مانند نواحی افزاینده[23] و خاموش­کننده[24]. در بخش 7.2 توالی‌های غیر رمزگذار اینترون بررسی می­شود.

غالب نواحی ژنوم یوکاریوت‌ها، شامل توالی غیر رمزگذار است.

درون ژنوم بخصوص در یوکاریوت‌ها، وجود توالی‌های تکراری، متداول است. دو تیپ توالی تکراری وجود دارد:  توالی‌های نسبتاً تکراری و توالی‌های بسیار تکراری (DNAهای ماهواره‌ای[25]). این دو تیپ توالی هر دو 5 تا 60 درصد کل ژنوم را تشکیل می‌دهند. در انسان‌، نزدیک به 60% از کل DNA، توالی‌های تکراری است.

یکی از نقاطی که توالی‌های تکراری در آن وجود دارد، انتهای کروموزوم یوکاریوتی است، به این ناحیه تلومر می‌گویند. تلومرها نقش محافظتی در فرآیند­های تقسیم سلولی و همانندسازی مداوم دارند. طی اینترفاز، آنزیم‌هایی که DNA را همانندسازی می‌کنند، قادر نیستند تا همانندسازی را تا انتهای کروموزوم ادامه دهند. از دست دادن توالی‌های تکراری موجود در تلومرها، عملکردی محافظتی است. اگر سلول‌ها بدون تلومر در چرخه سلولی پیش بروند، ممکن است ژن‌های موجود در انتهای کروموزوم‌ها را از دست بدهند.

 

نظریه علم

تا چه اندازه دانشمندان در دموکراسی نقش دارند ؟

الیزابت بلکبرن(Elizabeth Blackburn) یکی از مشهور‌ترین دانشمندان در حوزه مطالعات مرتبط با تلومر است. او به همراه یک دانشمند دیگر  و به دلیل کشف آنزیم تلومراز، مفتخر به دریافت جایزه نوبل پزشکی شد. او در سال 2004 به خاطر اعتراض به رأی شورا در محدود کردن تحقیقات سلول‌های بنیادی و انتقاد از حذف شواهد علمی از گزارش نهایی  از شورای ریاست اخلاق زیستی اخراج شد.

 

 

تعیین ویژگی­های DNA فرد(DNA profiling)

بررسی توالی­های تکراری (Tandem) برای فهمیدن مشخصات DNA (DNA profiling)

توالی­های تکراری متغیر پشت سرهم[26] ([27]VNTR)، توالی‌های کوتاه نوکلئوتیدی هستند که بر اساس اینکه چندبار در هر فرد تکرار شده‌اند، باعث ایجاد تنوع می­شوند. هر الگوی تنوعی می تواند   به شکل یک الل از هر والد به فرزند به ارث برسد. آنالیز ترکیب الل‌های VNTR در افراد مختلف مبنای DNA profiling است که برای کاربردهایی مانند مطالعات نسلی استفاده می‌شود.

لوکوس، جایگاه فیزیکی یک عنصر ژنتیکی وراثتی بر روی کروموزوم است. در مثال های فرضی نشان داده شده در شکل شماره 12،  لوکوس A یک  VNTRاز توالی “AT” و لوکوس B یک VNTR از توالی “TCG” دارد. در دو فرد نشان داده شده، دو اال متفاوت (واریته) از لوکوس A یعنی دو تکرار (الل A2) و چهار تکرار (الل A4) وجود دارد. در همان افراد سه الل برای لوکوس B یعنی سه تکرار ( الل B3) چهار تکرار ( الل B4) و پنج تکرار ( الل B5) وجود دارد.پروفایل DNA در نهایت شبیه الگویی از باندهاست که در انتهای شکل شماره 12 نشان داده شده است. توجه کنید که دو فرد دارای باندهایی مشابه و همینطور باندهایی متفاوت از یکدیگر هستند. دیرینه­ شناسان[28] تبار پدری را به­وسیله آنالیز توالی­های تکراری کوتاه (STR[29]) از کروموزوم Y و تبار مادری را از آنالیز انواع DNAهای میتوکندریایی در تک نوکلئوتیدهای موجود در نواحی با تنوع بالا بررسی می‌کنند.

آنالیز پروفایل DNA از طریق بررسی الل‌های توالی­های تکرار‌ی پشت سرهم

استفاده از لگاریتم راهی مناسب برای یک مسئله نمایی است. برای مثال:

Log 1000 = log103= 3     یا     = 2 log100 = log 102

در زیست شناسی، در صورت وجود تغییرات بسیار زیاد در متغیرها بهتر است از بیان متغیر ها بر پایه مقادیر  لگاریتمیدر  شیوه‌های گرافیکی استفاده شود.

در مثال شکل شماره 13، قطعات DNA به وسیله ژل الکتروفورز از یکدیگر جدا شدند. اندازه قطعات از 100 جفت باز تا 5000 جفت باز از یکدیگرمتفاوت هستند.

دو ستون بیرونی ژل نشان‌دهنده ladder‌ها، مخلوطی از DNAها با اندازه مشخص است. از این دو ستون برای تدوین داده‌های جدول 1 و نمودار شکل 14 استفاده شده است. ستون‌های بیرونی‌تر نشان دهنده قطعات ناشناخته هستند.

 

مسافت طی شده ( میلی‌متر) سایز قطعه ladder شناخته شده (bp)
58 5000
96 2000
150 850
200 400
250 100

جدول 1

  • از شکل شماره 14 برای تعیین سایز قطعات DNA در دو ستون 2 و 3 استفاده کنید:
مسافت طی شده ( mm) ستون 3 سایز قطعه( bp) ستون 3 مسافت طی شده ( mm) ستون 2 سایز قطعه(bp) ستون 2
70 60
160 70
200 130

جدول شماره 2

 

طرح سوال مبتنی بر داده: آنالیز پروفایل DNA بااستفاده از D1S80

یکی از لوکوس‌های DNA که تا به امروز بسیار مطالعه شده است، یک VNTR به نام D1S80 است. D1S80در کروموزوم شماره 1 انسان قرار دارد. این لوکوس ترکیبی از واحدهای تکراری به طول 16 نوکلوتید است. تعداد تکرارها از هر فرد به فرد دیگر متفاوت است به گونه‌ای که 29 الل متفاوت با دامنه‌ای بین 15 تا 41 تکرار شناسایی شده است.

در تصویری از یک پروفایل DNA (شکل شماره 15) خطوط خارجی و داخلی نشان‌دهنده ladderها به عنوان مضربی از 123جفت باز هستند.

الف) طول قطعات نشان داده شده به وسیله هر باند در ladder را مشخص کنید.

ب) با یک خط‌کش فاصله بین ابتدای صفحه (از بالا) و باند را معین کنید. با داده‌های به دست آمده از طول قطعات و همچنین فاصله قطعات تا ابتدای صفحه، به کمک یک گراف لگاریتمی، منحنی استاندارد را رسم کنید.

ج) فاصله طی شده توسط هر باند از آغاز صفحه را محاسبه کنید.

د) با استفاده از منحنی استاندارد، طول هر باند در هر فرد را تخمین بزنید.

ه) تعداد تکرارهای نشان داده شده به وسیله هر باند را تخمین بزنید.

و) در مورد فرد مربوط به خط 7، نامشخص است که دو نسخه از یک الل را دارد یا دو الل متفاوت دارد. چگونه می‌توان در مورد ژنوتیپ فرد آخر مطمئن شد؟

توالی یابی DNA

استفاده از نوکلئوتیدهای دی دئوکسی ریبونوکلوئیک اسید جهت توقف همانندسازی در فرآیند آماده‌سازی نمونه‌های توالی یابی.

تعیین توالی بازهای یک ژنوم عموماً به کمک روش‌های مبتنی بر استفاده از مواد فلوئوروسنس انجام می‌شود. برای توالی­یابی، نسخه‌های متعددی از DNA ناشناخته در لوله‌ آزمایش همراه با مواد مورد نیاز مانند دئوکسی ریبونوکلئوتیدها و آنزیم‌های لازم برای انجام همانندسازی، قرار  داده می­شود؛ در ادامه علاوه بر این مقدار بسیار کمی از دی دئوکسی ریبونوکلئوتیدها را که با مواد فلوئورسنت متفاوتی نشانگذاری شده‌اند نیز اضافه می‌گردد. دی دئوکسی ریبونوکلئوتیدها وارد برخی از DNAهای تازه سنتز شده می‌شوند و همانندسازی را دقیقاً در همان نقطه‌ای که وارد شده‌اند، متوقف می‌کنند. به کمک الکتروفورز قطعات بر اساس اندازه جدا می‌شوند. توالی بازها می‌تواند از طریق مقایسه رنگ‌های فلوئورسنت ساطع­شده از هر قطعه با طول مشخص آنالیز شود.

 

 

 

 

 

 

 

[1] DeoxyriboNucleic Acid

[2] Messenger RiboNucleic Acid

[3] Rosalind Franklin’s

[4] Maurice Wilkins’

[5] Alfred Hershey

[6] Martha Chase

[7] blender

[8] Supernatant

[9] Watson

[10] Crick

[11] Erwin Chargaff

[12] diffraction

[13] X-ray detector

[14] Linus Pauling

[15] naked

[16] linker

[17] Apoptosis

[18] Okazaki

[19] Single Stranded Binding Protein

[20] Primer

[21] Transfer RNA

[22] Ribosomal RNA

[23] enhancer

[24] silencer

[25] Satellite DNA

[26] variable number tandem repeat

[27] variable number tandem repeat

[28] Genealogists

[29] Short Tandem Repeat

اشتراک گذاری:

دیدگاهتان را بنویسید